武汉天德生物芯片技术服务_标本包埋

 标本包埋技术服务 

生物芯片技术服务中的标本包埋，一般是指将生物样本进行处理，使其能够更好地用于后续生物芯片分析等操作，常见的有组织石蜡包埋和琼脂包埋等。

一、组织石蜡包埋

组织石蜡包埋是病理诊断和研究中常用的技术手段，以下是详细介绍。

概念

组织石蜡包埋是将组织标本经过一系列处理后，用石蜡作为包埋介质，将组织包埋成块，以便进行切片、染色等后续操作，从而在显微镜下观察组织的形态结构和病理变化。

意义

• • 能够使组织细胞的形态和结构得到良好保存，防止组织自溶和腐败，保持组织的抗原性和核酸完整性，为病理诊断、免疫组化、原位杂交等检测提供高质量的样本。
  • 便于长期保存组织标本，在需要时可以随时取出进行切片和相关检测，为临床诊断和科研工作提供可靠的依据。

详细步骤

1. 取材与固定
   • 取材：选取具有代表性的新鲜组织，如手术切除的肿瘤组织、穿刺活检组织等，取材时应注意保持组织的完整性，避免挤压、牵拉等损伤，取材大小一般为 1.5cm×1.5cm×0.2cm 左右。
   • 固定：将取材后的组织立即放入固定液中，常用的固定液为 10% 中性缓冲福尔马林，固定时间一般为 6-24 小时，以确保组织充分固定。
2. 脱水与透明
   • 脱水：将固定好的组织依次经过梯度酒精进行脱水，一般从 70% 酒精开始，依次经过 80%、90%、95%、100% 酒精，每个浓度酒精浸泡 1-2 小时，大标本或脂肪含量高的组织可能需要适当延长时间。
   • 透明：脱水后的组织放入二甲苯中进行透明处理，组织在二甲苯中浸泡 1-2 小时，更换 1-2 次二甲苯，至组织完全透明。
3. 浸蜡与包埋
   • 浸蜡：将透明后的组织放入融化的石蜡中，在 56-60℃的温箱中进行浸蜡，一般经过 2-3 次浸蜡，每次 1-2 小时。
   • 包埋：将浸蜡后的组织放入预先准备好的包埋模具中，倒入融化的石蜡，迅速将模具放入冷水中或冰箱中，使石蜡快速凝固，形成组织蜡块。
4. 切片与展片
   • 切片：使用切片机将组织蜡块切成厚度为 3-5μm 的薄片，切片时要注意保持切片的完整性和连续性，避免切片出现皱褶、断裂等情况。
   • 展片：将切好的薄片放入 40-45℃的温水表面，使切片在水面上自然展平，然后用载玻片捞起切片，将其贴附在载玻片上。
5. 烤片与脱蜡
   • 烤片：将贴有切片的载玻片放入 60℃左右的烤箱中烤片 30-60 分钟，使切片与载玻片充分黏附。
   • 脱蜡：将烤好的切片依次放入二甲苯 Ⅰ、二甲苯 Ⅱ 中各浸泡 5-10 分钟，脱去切片中的石蜡。
6. 染色与封片
   • 染色：常用的染色方法为苏木精 - 伊红（HE）染色，包括苏木精染色、盐酸酒精分化、氨水返蓝、伊红染色等步骤，具体染色时间和条件可根据实际情况进行调整。
   • 封片：染色后的切片经过梯度酒精脱水、二甲苯透明后，用中性树胶进行封片，使切片能够长期保存并便于在显微镜下观察。

注意事项

• • 取材时要确保组织新鲜，避免组织自溶和干燥，固定要及时、充分，以保证组织的形态和结构得到良好保存。
  • 脱水和透明过程要严格控制时间和试剂浓度，避免组织过度脱水或透明不足，影响后续浸蜡和切片质量。
  • 浸蜡温度不宜过高，时间不宜过长，否则可能导致组织收缩、变硬，影响切片效果。
  • 切片时要调整好切片机的参数，保持刀片锋利，切片厚度要均匀一致，展片时水温要适宜，避免切片出现皱褶或破损。
  • 染色过程中要注意染色液的浓度、染色时间和分化程度，以获得理想的染色效果。

二、大组织大蜡块包埋

大组织大蜡块包埋与常规组织石蜡包埋原理相同，但在操作上有一些特殊的要点和注意事项，以下是详细介绍：

准备工作

• 模具选择：根据大组织的大小和形状，挑选尺寸合适、深度足够的包埋模具，确保组织能够完全放入，且与模具边缘保持一定距离，一般建议组织块与模具边缘至少间隔 5mm。 
•  石蜡准备：选用熔点合适的石蜡，一般为 56-60℃。由于大组织包埋需要较多石蜡，要提前准备充足，并确保石蜡纯净、无杂质。
• 器械准备：准备好镊子、刀片、包埋框、热台、冷台等工具，并确保热台温度能稳定保持在使石蜡融化且不损伤组织的范围，冷台温度足够低以利于石蜡快速凝固。

包埋步骤

1. 组织预处理：对大组织进行充分固定，固定时间可能需要适当延长，一般为 24-48 小时甚至更久，以保证组织内部也能固定良好。之后按照常规流程进行梯度酒精脱水、二甲苯透明和浸蜡处理，浸蜡次数可适当增加至 3-4 次，每次浸蜡时间 2-3 小时，确保石蜡充分浸入组织。
2. 包埋操作
   • • 放置模具：将选好的包埋模具放在热台上，倒入适量熔化石蜡，让石蜡均匀覆盖模具底部。
     • 放入组织：待模具内的石蜡稍微冷却，表面形成一层薄的凝固层时，用预热的镊子将组织块平整地放入模具中，注意组织的方向和切面要求，如皮肤组织应竖埋，最大切面朝下等。
     • 注蜡与加盖：继续向模具中倒入熔化石蜡，直至石蜡接近模具上缘。然后将包埋盒盖轻轻盖在模具上，确保盖子与模具底部平行，待四周石蜡初步凝固后，进行二次加蜡，但不要加得过满。
3. 冷却凝固：将包埋好的模具平稳移至冷台或冰水中，使石蜡快速凝固。对于大蜡块，可能需要更长的冷却时间，要确保石蜡完全凝固，一般需 15-30 分钟甚至更久。
4. 脱模与修整：待石蜡完全凝固后，小心打开模具，取出蜡块。用刀片或修蜡仪对蜡块进行修整，去除多余的石蜡，使蜡块边缘整齐，便于后续切片操作。

注意事项

• 温度控制：热台温度过高会损伤组织，过低则石蜡凝固过快，不利于操作。一般热台温度控制在 65-75℃，浸蜡温度控制在 58-62℃。
• 组织放置：大组织可能存在不同部位的结构差异，要根据观察需求确定组织的放置方向，保证切片能切到关键部位。
• 防止污染：包埋过程中要保持操作台面和工具的清洁，避免不同组织之间的交叉污染。
• 石蜡质量：使用质量好、纯净度高的石蜡，定期清理石蜡中的杂质和水分，防止影响包埋效果。
• 冷却速度：冷却速度过快可能导致蜡块内部产生应力，在切片时容易出现裂纹；冷却过慢则可能使组织与石蜡结合不紧密。可根据实际情况调整冷却方式和时间。

三、细胞石蜡包埋 

细胞石蜡包埋是将细胞进行处理后包埋在石蜡中，以便进行后续的切片观察和分析等操作，以下是其详细介绍：

基本原理

利用石蜡的物理特性，在一定温度下石蜡呈液态，可与经过处理的细胞充分混合，当温度降低时，石蜡凝固，将细胞包裹固定在其中，形成具有一定硬度和韧性的组织块，便于切成薄片在显微镜下进行观察和研究。同时，在包埋过程中通过各种化学试剂的处理，使细胞的形态、结构和成分得到尽可能的保存，以满足不同检测的需求。

详细步骤

1. 细胞收集与固定
   • 收集细胞：根据细胞来源和类型，采用合适的方法收集细胞。如对于悬浮细胞，可通过离心的方法，一般在 1000 - 2000 转 / 分钟下离心 5 - 10 分钟，使细胞沉淀；对于贴壁细胞，可先用胰酶等消化液将细胞消化下来，再进行离心收集。
   • 细胞固定：将收集到的细胞用适当的固定液进行固定，常用的固定液为 10% 中性缓冲福尔马林或 4% 多聚甲醛，固定时间一般为 15 - 30 分钟，以稳定细胞的形态和结构，防止细胞内的蛋白质、核酸等成分发生降解或改变。
2. 细胞脱水与透明
   • 梯度酒精脱水：固定后的细胞依次经过梯度酒精进行脱水，通常从 70% 酒精开始，依次经过 80%、90%、95%、100% 酒精，每个浓度酒精处理 5 - 10 分钟，去除细胞内的水分，为后续的浸蜡做好准备。
   • 二甲苯透明：脱水后的细胞用二甲苯进行透明处理，细胞在二甲苯中浸泡 5 - 10 分钟，更换 1 - 2 次二甲苯，使细胞呈现透明状态，便于石蜡的浸入。
3. 浸蜡与包埋
   • 浸蜡：将透明后的细胞放入融化的石蜡中，在 56 - 60℃的温箱中进行浸蜡，一般经过 2 - 3 次浸蜡，每次 15 - 30 分钟，使石蜡充分浸入细胞内部。
   • 包埋：将浸蜡后的细胞放入预先准备好的包埋模具中，倒入融化的石蜡，迅速将模具放入冷水中或冰箱中，使石蜡快速凝固，形成细胞蜡块。包埋时注意细胞的分布要均匀，避免细胞聚集在一侧或出现重叠。
4. 切片与展片
   • 切片：使用切片机将细胞蜡块切成厚度为 3 - 5μm 的薄片，切片时要注意保持切片的完整性和连续性，切片速度不宜过快，避免切片出现皱褶、断裂等情况。
   • 展片：将切好的薄片放入 40 - 45℃的温水表面，使切片在水面上自然展平，然后用载玻片捞起切片，将其贴附在载玻片上。
5. 烤片与脱蜡
   • 烤片：将贴有切片的载玻片放入 60℃左右的烤箱中烤片 30 - 60 分钟，使切片与载玻片充分黏附，防止在后续操作中切片脱落。
   • 脱蜡：将烤好的切片依次放入二甲苯 Ⅰ、二甲苯 Ⅱ 中各浸泡 5 - 10 分钟，脱去切片中的石蜡，为后续的染色等操作做好准备。
6. 染色与封片
   • 染色：根据实验目的和需求，选择合适的染色方法，如苏木精 - 伊红（HE）染色、免疫组化染色、特殊染色等。以 HE 染色为例，包括苏木精染色、盐酸酒精分化、氨水返蓝、伊红染色等步骤，具体染色时间和条件可根据实际情况进行调整。
   • 封片：染色后的切片经过梯度酒精脱水、二甲苯透明后，用中性树胶进行封片，使切片能够长期保存并便于在显微镜下观察。

注意事项

• • 细胞收集过程中要尽量保持细胞的完整性和活性，避免细胞损伤或死亡。
  • 固定时间要适当，固定不足可能导致细胞结构保存不佳，固定过度则可能影响细胞内抗原等成分的活性。
  • 脱水和透明过程要严格控制时间和试剂浓度，避免细胞过度脱水或透明不足，影响浸蜡和切片质量。
  • 浸蜡温度和时间要掌握好，温度过高或时间过长可能会对细胞造成损伤，影响细胞形态和成分。
  • 切片时要调整好切片机的参数，保持刀片锋利，切片厚度要均匀一致，展片时水温要适宜，避免切片出现皱褶或破损。

四、琼脂包埋

琼脂包埋常被用于微生物固定化以及类器官等样本的处理，以下分别介绍其在微生物固定化和类器官固定中的原理和步骤：

用于微生物固定化

原理：琼脂是一种天然高分子多糖，利用其在温度高于 50℃时熔化，而低于此温度时则凝固的特性，将其溶于水后与微生物混合，然后通过冷却凝固或加入非水相溶液，使微生物被截留在琼脂形成的凝胶网格孔隙的网络空间中，从而制成固定化微生物。

步骤

• 溶液准备：将琼脂加热溶于水，加热温度需高于 50℃，直至完全溶解，然后冷却至 45-50℃。
• 混合均匀：使琼脂溶液与微生物细胞按一定比例混合均匀，一般琼脂的最终浓度为 3％左右。
• 凝固成型：有两种方法。方法一是将琼脂与微生物细胞的混合液倒入已灭菌的培养皿中，使之冷却凝固；方法二是在 45-50℃条件下，将琼脂与微生物细胞混合物用针形管滴入上层是液体石蜡、下层是水的量筒中。
• 后续处理：若采用方法一，需将凝胶切成 3mm×3mm×3mm 的小方块，用生理盐水洗净，备用；若采用方法二，需滤出固定化细胞颗粒，用生理盐水洗净，备用。

用于类器官固定

原理：利用琼脂糖在加热融化后可流动，能包裹类器官，冷却后凝固形成固体的特性，将类器官固定在特定的空间位置，以便后续处理和观察，同时保护类器官的结构和功能。

步骤

• 类器官收集：如从培养孔板中收集生长至较大尺寸、密度合适的类器官，用移液枪吸取并清洗 1 至 3 遍，洗去大部分基质胶，然后离心沉淀，弃除大部分上清。
• 琼脂糖固定槽制备：称量 0.2 至 0.4g 琼脂糖，加入至烧杯或者小试剂瓶内，加入 10mL 左右 PBS，用微波炉高火融化，每隔 5s 暂停打开观察，重复数次至琼脂糖融化完全。取约 200μL 融化琼脂糖，加入至 600μL EP 管内，在盛有琼脂糖的小 EP 管内插入一小 PCR 管，使琼脂糖形成一圆尖底凹槽，室温或者 4℃冰箱静置数分钟，至琼脂糖凝固，轻轻转动小 PCR 管，取出 PCR 管，可看到琼脂糖内形成一个深圆尖底槽。
• 类器官固定：将类器官轻轻吸出转移至固定槽底部，轻轻加入 PBS 至高于琼脂糖槽的边缘，盖上盖子，用水平离心机 1000rpm 离心 5min，轻轻吸出除底部类器官沉淀外的 PBS 上清，加入 200μL 融化的琼脂糖液体，室温静置至琼脂糖完全凝固。
• 后续处理：剪去固定管的底部和盖子，置于 2mL EP 管内，加入多聚甲醛至差不多装满整个 EP 管，置于 4℃冰箱过夜。之后进行脱水、透明、浸蜡等操作，具体为在梯度乙醇中脱水，70%、80%、90%、95% 乙醇各 1h，100% 乙醇 30min；将脱水完成后的琼脂糖块转移至组织包埋盒中，将包埋盒转移至二甲苯中 5min 处理两次；透明化处理完成后立即转入已经融化的蜡缸中，60℃浸蜡 2h 后，更换新的蜡缸再次浸蜡 2h；最后进行包埋，在冰盒上进行，将融好的纯蜡倒入蜡盒三分之一处，将琼脂块放置于中间位置，然后再滴蜡包埋直到倒满，待蜡块完全凝固后，小心脱下模具。

五、肠瑞士卷包埋

肠瑞士卷包埋是一种用于肠道组织学研究的包埋技术，以下是其原理及步骤：

原理

将肠道组织沿长轴方向剪开后，再将其沿剪开方向卷成类似瑞士卷的形状，然后进行包埋。这样可以在一张切片上体现全长肠道的所有特征，有助于保持肠道组织的完整性和三维结构，便于研究人员对肠道进行详细而广泛的组织学分析。

步骤

1. 取材与固定
   • 处死动物：以小鼠为例，采用颈椎脱臼法等方式将动物处死，然后剃除小鼠腹部毛发，于腹正中线处剪一个小的 V 形切口，向上至胸骨、向下至耻骨剪开皮肤，充分暴露腹腔。
   • 游离肠道：寻找胃与食管的交界处，于稍上方将其剪断，以断端为起始点，将胃肠道从腹腔中游离出来，同时剥离相关肠系膜及结缔组织，游离过程中适时用冷 PBS 冲淋胃肠道，使其保持湿润。
   • 分段标记：将完整胃肠道游离出腹腔后，立即浸泡在冷 PBS 中，用解剖剪将小肠按长度均分为三段，从胃侧向盲肠侧，依次标记为 SB1、SB2、SB3，剪去盲肠后，留下的大肠标记为 LB。
   • 冲洗内容物：使用装满冷 PBS 的简易冲洗管冲洗肠道内容物，简易冲洗管可由 10ml 注射器和剪去针头的头皮针管头制作而成。
2. 纵切肠道
   • 准备纵切台：将裁剪好的吸水纸 A 用冷 PBS 浸湿后，放置在底座的台面上，然后将四根不锈钢棒依次穿过 SB1、SB2、SB3 和 LB 的肠腔，随后固定在台面上并放置好盖子。
   • 划开肠道：一手持镊子夹稳肠管最前端，另一手持无菌手术刀，以盖子中间的侧壁为支点，将肠道沿纵轴平整划开，若肠道仍部分贴合在不锈钢棒上，可使用装满冷 PBS 的 10ml 注射器沿手术刀切开方向喷洒液体，使肠道平铺在吸水纸 A 上。
3. 初步固定：取下不锈钢棒后，用冷 PBS 湿润另一张吸水纸 B，将其覆盖在切开的肠道组织上，将两张对合完全的吸水纸沿其长轴方向卷起成一空心管状，放入装满 4％PFA 的 50ml 离心管中，室温下固定 24 小时。
4. 脱水处理：固定 24 小时后，将 PFA 替换为 15％蔗糖溶液，进行脱水 24 小时，之后再将其替换为 30％蔗糖溶液，继续脱水 24 小时。
5. 制作肠卷
   • 展平吸水纸：30％蔗糖脱水 24 小时后，将吸水纸从 50ml 离心管中取出，以吸水纸 B 朝上的方向在台面上展平。
   • 卷绕肠道：小心掀开吸水纸 B，一手持弯镊夹住肠道的最前端，另一手持另一把镊子或徒手，轻轻夹住肠道的最远端，以肠粘膜面朝内为方向，将肠道卷起成一管状，随后用 30g 针头以肠道最外侧端的稍内侧为入点，扎穿过整个肠卷，防止其散开，小心松开弯镊，使其从固定好的肠卷中抽离出来。
   • 放置肠卷：小心拔出 30g 针头，将四个肠卷按顺序直立放置在组织包埋盒中。
6. 包埋：用 OCT 完整包裹住肠卷，然后将其放置在冰冻切片机的速冻台上速冻包埋，在 OCT 变白变硬后即可进行切片，也可保存于 - 80℃冰箱中备用。若采用石蜡包埋，则按常规石蜡包埋流程，进行浸蜡、包埋等操作。

六、斑马鱼包埋

斑马鱼包埋是斑马鱼组织学研究、胚胎学研究等实验中的重要环节，以下是常见的斑马鱼包埋方法及相关内容介绍：

石蜡包埋

• 取材：根据实验目的，选取合适发育阶段的斑马鱼胚胎或成鱼组织。对于胚胎，通常在特定发育时间点收集；对于成鱼，可解剖获取特定组织器官，如心脏、肝脏等。
• 固定：将取材后的斑马鱼样本放入合适的固定液中，如 4% 多聚甲醛，固定一段时间，一般胚胎固定 24 小时左右，成鱼组织根据大小和类型适当延长固定时间，以确保组织细胞的形态和结构得到良好保存。
• 脱水：依次经过不同浓度梯度的乙醇溶液，如 70%、80%、90%、95%、100% 乙醇进行脱水，每个浓度梯度浸泡一定时间，去除组织中的水分，为后续的浸蜡和包埋做准备。
• 透明：使用二甲苯等透明剂对脱水后的样本进行处理，使组织透明，便于石蜡渗透。
• 浸蜡：将透明后的样本放入融化的石蜡中，在特定温度下（如 60℃左右）进行浸蜡，一般需要经过 2-3 次浸蜡，每次浸蜡时间 1-2 小时，让石蜡充分渗透到组织中。
• 包埋：将浸蜡后的样本放入包埋模具中，倒入融化的石蜡，待石蜡冷却凝固后，即可得到包埋好的斑马鱼组织蜡块。

冰冻包埋

• 取材与固定：与石蜡包埋类似，先选取合适的斑马鱼样本并进行固定，固定液一般也可选用 4% 多聚甲醛等。
• 平衡：将固定后的样本放入蔗糖溶液中进行平衡，通常使用 15% - 30% 的蔗糖溶液，根据样本大小和类型确定平衡时间，一般为 12-24 小时，使组织中的水分被蔗糖溶液置换，减少冰冻过程中冰晶的形成。
• 包埋：将平衡好的样本放入冰冻包埋剂中，如 OCT（optimal cutting temperature compound），放置在冰冻切片机的样本托上，迅速放入液氮或干冰乙醇浴中进行速冻，使包埋剂和组织快速冻结，形成坚硬的冰冻包埋块。

树脂包埋

• 取材与固定：选取合适的斑马鱼样本，使用戊二醛、锇酸等固定液进行固定，以更好地保存细胞超微结构。
• 脱水：采用与石蜡包埋类似的乙醇梯度脱水方法，但脱水时间可能需要更精确控制。
• 渗透与包埋：使用树脂（如环氧树脂等）对脱水后的样本进行渗透，将样本放入含有树脂的模具中，在一定温度和时间条件下使树脂聚合固化，形成树脂包埋块。树脂包埋块硬度较高，适合进行超薄切片等精细操作，用于电子显微镜观察等研究。

七、硬组织样本包埋

硬组织样本包埋是将骨骼、牙齿等硬组织进行处理并包埋在特定介质中，以便后续切片、观察和分析的技术，以下是其常用方法及流程介绍：

塑料包埋

• 样本准备：获取硬组织样本后，先去除样本表面的软组织、血液等杂质，用生理盐水冲洗干净。对于体积较大的样本，可能需要进行适当切割，以便后续处理。
• 固定：将样本放入合适的固定液中，如 10% 中性缓冲福尔马林，固定时间通常为 24-48 小时，以稳定组织的形态和结构。
• 脱钙：硬组织含有大量钙盐，需要进行脱钙处理，常用的脱钙液有乙二胺四乙酸（EDTA）溶液、硝酸等。将样本浸泡在脱钙液中，定期更换脱钙液并监测脱钙程度，一般需要数天至数周时间，直至样本可以用刀片轻松切入。
• 脱水：脱钙后的样本依次经过不同浓度梯度的乙醇溶液进行脱水，如 70%、80%、90%、95%、100% 乙醇，每个浓度浸泡 1-2 小时，去除组织中的水分。
• 透明：将脱水后的样本放入二甲苯等透明剂中，浸泡 1-2 小时，使组织透明，为树脂渗透做准备。
• 包埋：将透明后的样本放入塑料包埋剂中，如甲基丙烯酸甲酯（MMA），在一定温度和湿度条件下，使包埋剂聚合固化，通常需要数天时间，形成坚硬的塑料包埋块。

石蜡包埋

• 样本处理与固定：与塑料包埋的前期步骤类似，对硬组织样本进行清洗、固定。固定时间可能需要适当延长，以确保固定效果。
• 脱钙：使用合适的脱钙方法和脱钙液进行脱钙，脱钙过程中要注意控制时间和脱钙程度，避免过度脱钙导致组织损伤。
• 脱水、透明：经过乙醇梯度脱水和二甲苯透明处理，与塑料包埋中的脱水、透明步骤基本相同，但在时间控制上可能略有差异，需根据样本大小和质地进行调整。
• 浸蜡：将透明后的样本放入融化的石蜡中，在 60℃左右的温度下进行浸蜡，一般需要经过 3-4 次浸蜡，每次浸蜡 1-2 小时，使石蜡充分渗透到组织中。
• 包埋：将浸蜡后的样本放入包埋模具中，倒入融化的石蜡，待石蜡冷却凝固，得到石蜡包埋块。石蜡包埋块较软，在切片时需要使用锋利的刀片和适当的切片技术。

树脂包埋

• 样本固定：采用戊二醛、锇酸等固定液对硬组织样本进行双重固定，以更好地保存细胞超微结构，固定时间一般为 2-4 小时。
• 脱水：使用乙醇或丙酮等有机溶剂进行梯度脱水，脱水时间根据样本大小和类型而定，一般从低浓度到高浓度逐步进行，每个浓度浸泡 30 分钟至 1 小时。
• 渗透：将脱水后的样本放入树脂渗透液中，如环氧树脂、丙烯酸树脂等，在室温下渗透 12-24 小时，使树脂充分进入组织内部。
• 包埋：将渗透好的样本放入包埋模具中，加入适量树脂包埋剂，在一定温度和湿度条件下进行聚合反应，通常需要在 60-80℃的烘箱中烘烤 24-48 小时，使树脂固化形成坚硬的包埋块。

八、组织芯片定位

组织芯片定位是组织芯片技术中的关键环节，对于准确获取和分析组织样本信息至关重要，以下从定位方法及相关技术等方面进行介绍：

定位方法

• 坐标定位法：在制作组织芯片时，会在受体蜡块上按照一定的行列顺序进行打孔，每个孔都有特定的坐标位置。在进行后续的实验分析如免疫组化、原位杂交等时，就可以根据这些坐标来准确找到每个组织样本在芯片上的位置，便于对不同样本进行对比观察和分析。
• 标记定位法
  • 荧光标记：利用荧光染料对组织样本中的特定成分进行标记，在荧光显微镜下，根据荧光信号的位置来确定组织样本的位置和分布。例如，对细胞核进行 DAPI 荧光染色，可清晰显示细胞的位置，进而确定组织的位置。
  • 放射性标记：将放射性核素标记的探针与组织芯片上的目标核酸或蛋白质等进行特异性结合，通过放射性探测设备来定位标记信号，从而确定组织中目标物质的位置。常用于基因表达分析等研究。
  • 酶标记：通过酶标抗体与组织中的抗原结合，加入酶的底物后，酶催化底物产生显色反应，根据颜色变化来定位组织中的抗原位置。如常用的辣根过氧化物酶（HRP）标记，在免疫组化实验中广泛应用。

定位技术

• 显微镜定位技术：普通光学显微镜可直接观察组织芯片上组织的形态和结构，根据组织的特征和预先设定的标记等进行定位。此外，荧光显微镜用于观察荧光标记的组织芯片，共聚焦显微镜能对组织进行三维成像，更精确地定位组织中的目标结构或分子。
• 图像分析软件定位技术：通过专门的图像分析软件，对组织芯片的图像进行处理和分析。软件可以识别组织的边界、标记信号等特征，自动或辅助人工进行组织定位，并能进行定量分析，如计算标记信号的强度、面积等。
• 激光捕获显微切割技术（LCM）中的定位：在 LCM 技术中，需要精确地定位并切割出组织芯片上的特定细胞或组织区域。通过显微镜观察，利用激光束对目标区域进行精确切割，将所需的组织或细胞从芯片上分离出来，用于后续的分子生物学分析等。

九、组织芯片蜡块制作

组织芯片蜡块制作是一项精细的技术，以下是其详细制作流程：

准备工作

• 仪器设备：准备好组织芯片仪、石蜡包埋机、切片机、显微镜、镊子、刀片、包埋模具等。
• 耗材试剂：购买高纯度石蜡、组织固定液（如 10% 中性缓冲福尔马林）、防脱载玻片、苏木精 - 伊红（HE）染色试剂等。
• 组织样本：收集各种来源的组织样本，如手术切除标本、穿刺活检标本等，确保样本具有代表性且保存完好。

具体步骤

1. 组织固定：将获取的组织样本立即放入 10% 中性缓冲福尔马林中进行固定，固定时间根据组织类型和大小而定，一般为 6-24 小时，以确保组织细胞的形态和结构得到良好保存。
2. 脱水透明
   • 脱水：将固定好的组织依次经过梯度浓度的乙醇溶液进行脱水，一般从 70% 乙醇开始，依次经过 80%、90%、95%、100% 乙醇，每个浓度浸泡 1-2 小时，去除组织中的水分。
   • 透明：脱水后的组织放入二甲苯等透明剂中浸泡，使组织透明，便于后续石蜡渗透，一般浸泡 1-2 小时。
3. 浸蜡包埋
   • 浸蜡：将透明后的组织放入融化的石蜡中，在 60℃左右的温度下进行浸蜡，一般经过 3-4 次浸蜡，每次 1-2 小时，使石蜡充分渗透到组织中。
   • 包埋：将浸蜡后的组织放入包埋模具中，倒入融化的石蜡，待石蜡冷却凝固，制成常规石蜡组织块。
4. 切片与 HE 染色
   • 切片：用切片机将石蜡组织块切成厚度为 3-5 微米的薄片，将切好的薄片漂浮在温水表面，使切片展平，然后捞起贴附在防脱载玻片上。
   • HE 染色：对切片进行常规 HE 染色，通过苏木精染液对细胞核进行染色，伊红染液对细胞质进行染色，使组织细胞的形态结构清晰可见，便于观察和筛选。
5. 组织芯片蜡块制作
   • 选取样本：在显微镜下观察 HE 染色切片，根据研究目的和组织特征，选取合适的组织区域作为供体样本。
   • 打孔取样：使用组织芯片仪，在供体石蜡组织块上对应选取的区域进行打孔，取出直径通常为 0.6-2 毫米的组织芯。
   • 受体蜡块准备：准备一个空白的石蜡块作为受体蜡块，使用组织芯片仪在受体蜡块上按照一定的排列顺序进行打孔，孔的大小与组织芯匹配。
   • 组织芯转移：将取出的组织芯依次转移到受体蜡块的孔中，确保组织芯排列整齐、紧密，制成组织芯片蜡块。

在制作过程中，组织固定要充分，避免组织自溶或变形；脱水透明要彻底，否则会影响石蜡渗透和切片质量；切片时要保持刀片锋利，切片厚度均匀；组织芯的选取和转移要准确，保证组织芯片的质量和实验结果的准确性。

十、细胞芯片蜡块制作

细胞芯片蜡块制作与组织芯片蜡块制作有一定相似性，但也有其独特之处，以下是细胞芯片蜡块制作的一般步骤：

准备工作

• 仪器与耗材：准备离心机、细胞培养箱、移液器、细胞筛、载玻片、盖玻片、包埋模具、组织芯片仪等仪器和耗材。
• 试剂：准备细胞培养基、胰蛋白酶、多聚甲醛、乙醇、二甲苯、石蜡、PBS 缓冲液等试剂。
• 细胞样本：根据实验目的，培养或收集所需的细胞样本，确保细胞的活性和数量。如培养肿瘤细胞系用于肿瘤相关研究，或收集外周血单个核细胞用于免疫相关研究等。

具体步骤

1. 细胞收集与处理
   • 消化细胞：对于贴壁细胞，使用胰蛋白酶将细胞从培养瓶或培养皿中消化下来；对于悬浮细胞，可直接收集细胞悬液。
   • 离心收集：将细胞悬液转移至离心管中，以适当的转速（如 1000-1500rpm）离心 5-10 分钟，弃去上清液，收集细胞沉淀。
   • 细胞计数：使用细胞计数板或细胞计数仪对细胞进行计数，调整细胞浓度至合适范围，一般为 1×10⁶ - 1×10⁷个 /mL。
2. 细胞固定
   • 重悬细胞：用 PBS 缓冲液将细胞沉淀重悬，轻轻吹打使细胞均匀分散。
   • 加入固定液：缓慢加入适量的 4% 多聚甲醛溶液，使细胞充分固定，固定时间一般为 15-30 分钟。
3. 脱水透明
   • 梯度乙醇脱水：将固定好的细胞依次经过梯度浓度的乙醇溶液进行脱水，从 70% 乙醇开始，依次经过 80%、90%、95%、100% 乙醇，每个浓度处理 10-15 分钟。
   • 二甲苯透明：将脱水后的细胞放入二甲苯中浸泡 10-15 分钟，使细胞透明。
4. 浸蜡
   • 初浸蜡：将透明后的细胞放入融化的低熔点石蜡中，在 37℃左右的温度下浸泡 30-60 分钟。
   • 终浸蜡：将细胞转移至融化的高纯度石蜡中，在 60℃左右的温度下进行 2-3 次浸蜡，每次 30-60 分钟，使石蜡充分渗透到细胞中。
5. 包埋
   • 模具准备：将包埋模具放置在平整的台面上，准备好包埋用的镊子等工具。
   • 细胞转移：用镊子或移液器将浸蜡后的细胞转移到包埋模具中，尽量使细胞分布均匀。
   • 灌注石蜡：向模具中缓慢倒入融化的石蜡，直至将细胞完全覆盖，待石蜡冷却凝固，形成细胞蜡块。
6. 切片与贴片
   • 切片：使用切片机将细胞蜡块切成厚度为 3-5 微米的薄片。
   • 贴片：将切好的薄片漂浮在温水表面，使切片展平，然后捞起贴附在载玻片上，烘干备用。
7. 细胞芯片制作
   • 打孔：使用组织芯片仪，根据需要在细胞蜡块上打孔，孔的直径通常为 0.6-2 毫米。
   • 转移：将打好的细胞芯转移到受体蜡块的相应孔中，排列整齐，制成细胞芯片蜡块。

整个制作过程要注意保持细胞的完整性和活性，严格控制各步骤的时间和温度等条件，确保细胞芯片蜡块的质量，为后续的免疫组化、原位杂交等实验提供良好的样本基础。