β-Actin 酶联免疫检测试剂盒说明书

一、试剂盒简介

二、试剂盒组分

三、保存

本试剂盒各组分按标签温度保存，有效期6个月。

四、所需仪器

酶标仪（波长450 nm），10 μL、100 μL、1 mL移液器，300 μl多道移液器，移液器吸头、37℃恒温水浴箱。

五、操作步骤

1、actin标准品溶液配制。取8个新EP管，分别标记1-8#。在1#管中加入990μL样品稀释液，2-8#管中分别加500μL样品稀释液。加入10μL标准品（100 ug/mL）到1#管中，剧烈振荡。从1#管中取出500μL加入2#管，剧烈振荡。同样方法完成3-8#管的稀释（1-8#管actin浓度分别是1000、500、250、125、62.5、31.25、15.625 ng/mL）。稀释好的标准品建议在15min内使用。另外，标记一个新EP管为B0（maximum binding，0 ngmL），加入500μL 样品稀释液。

2、将浓缩洗涤液用蒸馏水做10倍稀释。配好的洗涤液可室温保存3个月（但不能超出试剂盒的保质期）。

3、取出包被有抗β-actin的96孔酶标板在室温放置回温。标准品各浓度做平行两孔，100 μL/孔加入酶标板中。加待检样品各两孔，100 μL/孔。37℃孵育1小时。用洗涤液洗涤三遍，拍干。

4、将检测抗体用抗体稀释液做1:500稀释，加入各反应孔，100 μL/孔（检测抗体用多少稀释多少，现用现配）。加样过程须在15 min内完成。置37℃孵育1小时，用洗涤液洗涤三遍，拍干。

5、将HRP-羊抗鼠二抗用抗体稀释液做1:5000稀释，加入各反应孔，100 μL/孔。置37℃孵育1小时，用洗涤液洗涤四遍，拍干。

6、用移液器加TMB底物显色液100 μL/孔，室温20–24℃避光反应10 min，请勿震荡。

7、用移液器加终止液50 μL/孔，稍微震荡5s混匀。

8、在酶标仪450 nm波长处读数。

六、注意事项

1、如样品中β-Actin含量高于1000 ng/mL，可将样品做适当稀释。

2、样品如为冻干制剂，应用样品稀释液充分溶解混匀。

3、反应时应将整板放入洁净的密闭空间中，为防止反应孔中落入异物。

4、洗涤拍干后，应消除各孔内残余的气泡。

5、开封后，将未使用的板条放回加入干燥剂的密封塑料袋中，置4℃密闭保存。

6、在操作过程中，所使用的移液器吸头、洗涤机（瓶）、器皿等均应严格避免被污染。

七、结果判定

1、实验有效参数。实验结果须满足以下有效参数为成立：

0 ng/ml OD值≤0.1； 1000 ng/ml OD值≥0.80； R2≥0.98；

2、计算。在EXCEL里面以标准浓度为横坐标，消零OD值为纵坐标作散点图，添加趋势线，再显示曲线方程和R2值，将检测样品OD值消零处理后带入直线方程计算对应的浓度。

3、判定。在标准曲线中，设OD 0–500 ng/mL为区间A；OD 500–1000 ng/mL为区间B；大于OD 1000 ng/mL为区间C。