人髓样前体细胞抑制因子2（MPIF2）ELISA Kit

货号：TD-EH10010

保质期：请见试剂盒外包装标签。

技术支持：为了更好地给您提供服务，联系时请告知产品外包装标签上批号。

用途

该试剂盒用于体外定量检测血清、血浆或其他相关生物液体中Human MPIF2浓度。

灵敏度、检测范围、特异性和重复性

1. 灵敏度：46.87pg/mL。
2. 检测范围：78.12-5000pg/mL。
3. 特异性：可检测样本中的Human MPIF2,且与其它类似物无明显交叉反应。
4. 重复性：板内，板间变异系数均<10%。

检测原理

本试产品采用双抗体夹心ELISA法。用抗Human MPIF2抗体包被于酶标板上，实验时样品（或标准品）中的Human MPIF2会与包被抗体结合。后依次加入生物素化的抗Human MPIF2抗体和HRP酶标记的亲和素，抗Human MPIF2抗体与结合在包被抗体上的Human MPIF2结合，生物素与亲和素特异性结合而形成免疫复合物，游离的成分被洗去。加入显色底物(TMB)，TMB在HRP酶的催化下呈现蓝色，加终止液后变成黄色。用酶标仪在450 nm波长处测OD值，Human MPIF2浓度与OD450 OD值之间呈正比，通过绘制标准曲线计算出样品中Human MPIF2的浓度。

试剂盒组成及保存

未开封试剂盒应保存在2-8℃。收到货后请参照下表中保存条件进行存储。

说明：
保存时请确保所有试剂瓶的瓶盖都旋紧，以防止试剂蒸发和避免微生物污染。
试剂在分装时会比标签上标明的体积稍多一些，请在使用时量取而非直接倒出。

检测前注意事项

1. 试验中请穿戴好防护装备，接触血液样本或其它生物样本时，请参照国家生物实验室安全防护条例做好生物安全防护工作。
2. 不同批号的试剂盒组份不能混用(Stop Solution除外)。
3. 试验中所用的EP管和吸头均为一次性使用，请勿混用。
4. 刚开封的酶标板孔中可能会有少许水样物质，此为正常现象，不会对实验结果造成影响。暂时不用的板条应放入备用铝箔袋，按照组分表中保存条件进行存放。
5. 已稀释过的标准品及生物素化抗体工作液、酶结合物工作液请勿重复使用。
6. 未用完的浓缩生物素化抗体(100×)、浓缩HRP酶结合物(100×)及其它原液请按照组分表中的保存条件进行存放。
7. 酶标仪需要安装能检测450±10nm波长的滤光片，检测范围在0-3.5之间。

检测前自备物品

1. 酶标仪（450nm波长滤光片）、37℃恒温孵育箱。
2. 1.5mL EP管、吸水纸。
3. 移液器及一次性吸头：0.5-10μL, 2-20μL, 20-200μL, 200-1000μL。
4. 双蒸水或去离子水。

检测前准备工作

1. 平衡至室温：将试剂盒提前20分钟取出冰箱，使其平衡至室温。
2. 酶标仪预热：检测时，请至少提前15分钟打开酶标仪，使酶标仪光源稳定。
3. 洗涤液制备：将浓缩洗涤液用双蒸水稀释(1:24)。
   提示：从冰箱中取出的浓缩洗涤液可能有结晶，属于正常现象，可用40℃水浴微加热使结晶完全溶解后再配制洗涤液。当日使用。
4. 标准品工作液制备：
   4.1 将标准品于10000×g离心1分钟。
   4.2 向冻干标准品中加入1.0 mL标准品及样品稀释液。旋紧管盖后，静置10分钟。期间上下颠倒管子数次，以助于标准品的溶解。
   4.3 待标准品完全溶解后，用移液枪轻轻混匀，制备成5000pg/mL的标准品工作液。
   4.4 根据实验需求，对标准品进行倍比稀释，建议配制的浓度梯度为：5000、2500、1250、625、312.5、156.25、78.12、0 pg/mL。
   4.5 倍比稀释方法：
   准备7支EP管，每管加入500μL的标准品&样品稀释液。
   从5000pg/mL的标准品工作液中取500μL，加入到第一支EP管中，移液枪混匀，制备成2500 pg/mL的标准品工作液。
   接着，从2500 pg/mL的EP管中取500μL，加入到第二支EP管中，移液枪混匀，制备成1250 pg/mL的标准品工作液，以此类推，得到倍比稀释的标准品工作液。
   注意：最后一管作为空白对照。加入标准品&样品稀释液即可。
5. 生物素化抗体工作液制备：
   计算用量：以100μL/孔的试剂需求量进行计算，并额外增加100-200μL，以备不时之需。
   抗体稀释：在实验前15分钟，使用生物素化抗体稀释液将浓缩生物素化抗体(100×)稀释并混匀至1×工作浓度。稀释后的抗体应于当日使用，以保证实验效果。
6. 酶结合物工作液：
   计算用量：以100μL/孔的试剂需求量进行计算，并额外增加100-200μL，以备不时之需。
   抗体稀释：在实验前15分钟，使用生物素化抗体稀释液将浓缩HRP酶结合物(100×)稀释并混匀至1×工作浓度。稀释后的抗体应于当日使用，以保证实验效果。

实验操作过程

1. 加标准品&样品：
   将不同浓度标准品工作液按从上到下顺序加入到前两列酶标板孔中，每个浓度两孔，每孔100μL；待测样品加入其余孔，每孔100μL。高浓度样品需先稀释。
   操作时，从酶标板底部加样，避免接触孔壁，轻轻晃动混匀，避免产生气泡，加样操作控制在10分钟内完成。
2. 覆板&孵育：
   撕开封板覆膜，将板孔覆盖紧密。37℃孵育90min。
3. 加生物素化抗体：
   撕开覆膜，清除并甩干板孔内液体，无需洗涤。
   按100μL/孔向所有孔加入稀释好的生物素化抗体工作液。轻轻晃动混匀，覆盖酶标板覆膜。37℃孵育60min。
4. 洗板1：
   清除并甩干板孔内液体，按350μL/孔，加入稀释好的洗涤液，浸泡1-2min，清除并甩干板孔内液体，在厚吸水纸上拍干板孔，完成一次洗涤。
   总计洗板3次。甩干板孔液体供下一步使用。
5. 加酶结合物工作液：
   按100μL/孔向所有孔加入稀释好的酶结合物工作液。轻轻晃动混匀，覆盖酶标板覆膜。37℃孵育30min。
6. 洗板2：
   洗板5次，步骤同第4步洗板1操作。
7. 加底物溶液(TMB)：
   按90μL/孔向所有孔加入底物溶液(TMB)。覆盖酶标板覆膜。37℃，避光孵育15min左右。
   提示：根据显色情况调整孵育时间，但不要超过30分钟。一旦标准孔显示出清晰的梯度，即可停止孵育。
8. 终止反应：
   按50μL/孔，向所有孔加入终止液，终止反应。
   提示：终止液的加入顺序应尽量与底物溶液的加入顺序相同。
9. 测量OD值：
   立即用酶标仪在450nm波长测量酶标板各孔的OD值(光密度)。

检测结果计算

1. 计算平均OD值并绘制标准曲线：
   计算每组标准品复孔的平均OD值。
   从每个标准品的平均OD值中减去空白孔的OD值，得到标准品矫正OD值。
   以浓度为横坐标，OD值为纵坐标，使用Logistic函数绘制标准曲线。绘制时排除空白组的OD值。
2. 样本浓度计算：
   将样本测得的OD值带入曲线中即可求出样本OD值对应浓度。样本若有稀释倍数，在所得浓度上乘以稀释倍数即可得到样本原液浓度。
3. 高OD值样品处理：
   如果样品的OD值超过了标准曲线的上限，应适当稀释样品后重新测量。

问题分析

如果实验结果不理想，请立即拍摄显色结果的照片，保存所有实验数据，并保留使用过的板条以及未用尽的试剂。之后，请联系我们的技术支持团队，以便我们协助您解决问题。同时，您也可以查阅以下资料以获取更多帮助。

样品收集方法

1. 血清：全血样品于室温放置2小时或4℃过夜后于1000×g离心20分钟，取上清即可检测。收集血液的试管应为一次性的无内毒素试管。
2. 血浆：抗凝剂推荐使用EDTA-Na₂，样品采集后30分钟内于1000×g离心15分钟，取上清即可检测。避免使用溶血，高血脂样品。
3. 组织匀浆：用预冷的PBS (0.01M, pH=7.4)冲洗组织，去除残留血液，称重后将组织剪碎。将剪碎的组织与对应体积的PBS(一般按1:9的重量体积比，如1g的组织样品加入9mL的PBS，具体比例可根据实验需要适当调整。推荐在PBS中加入蛋白酶抑制剂)加入玻璃匀浆器中，在冰上充分研磨。为了进一步裂解组织细胞，可以对匀浆液进行超声破碎或反复冻融。最后将匀浆液5000×g离心5~10分钟，取上清检测。
4. 细胞提取液：
   贴壁细胞：用预冷的PBS轻轻清洗，然后用胰蛋白酶消化，1000×g离心5分钟后收集细胞。
   悬浮细胞：可直接离心收集。
   收集的细胞用预冷的PBS洗涤3次。每10⁶个细胞中加入150-200μL PBS重悬并通过反复冻融使细胞破碎(若含量很低可减少PBS的体积)。将提取液于1500×g离心10分钟，取上清检测。
5. 细胞培养上清或其他生物体液：收集液体后1000×g离心20分钟，除去杂质及细胞碎片。取上清检测。

样品注意事项

1. 样品收集后保存说明：
   1周内检测：2-8℃，保存。
   1个月内检测：请分装成单次使用量，并保存于-20℃。
   3个月内检测：请分装成单次使用量，并保存于-80℃。
2. 请留意，您样本的浓度范围可能超过试剂盒的检测范围。如遇此情况，建议先进行预实验，以确定合适的稀释比例，确保结果的准确性。(建议查阅文献后先做预实验，以确定稀释倍数)
3. 若所检样本不在说明书所列样本之中，建议做预实验验证其检测有效性。
4. 若使用化学裂解液制备组织匀浆或细胞提取液，由此引入的某些化学物质可能会导致测值结果出现偏差。
5. 请知悉，部分重组蛋白可能与试剂盒中的捕获或检测抗体不匹配，导致无法检测。

产品使用声明：

1. 质量技术风险提示：受限于当前科学技术水平和条件限制，尚无法对所有原料进行全面的鉴定分析。本产品可能存在一定的质量技术风险。
2. 实验结果影响因素：实验结果受试剂有效性、操作者技能和实验环境等多种因素影响。为确保结果准确性，请准备充足的待测样品。
3. 试剂使用指南：为获得最佳实验效果，建议仅使用本试剂盒内提供的试剂，并严格按照说明书操作。避免与其他制造商的产品混用。
4. 操作注意事项：不正确的试剂配制或酶标仪参数设置可能导致实验结果异常。请在实验前仔细阅读说明书，并正确调整仪器参数。
5. 结果重现性：即使是同一操作者，在两次独立实验中也可能得到不同结果。为确保结果的重现性，请严格控制实验过程中的每一步操作。
6. 质量保证与差异说明：尽管试剂盒在发货前经过严格质检，但由于运输条件、实验设备差异等因素，用户检测结果可能与出厂数据存在差异。不同批次试剂盒间的差异也可能源于上述原因。