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Protein A ELISA 检测试剂盒
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Protein A ELISA 检测试剂盒说明书
96 Test
货号： Bk301
适用范围：
此 Protein A ELISA 检测试剂盒用于定量检测重组耐碱性蛋白 A，只能用于科研和生产，不能应用于人或动物疾病 的诊断、治疗。本试剂盒提供一种样品的酸化处理方法，把蛋白 A 从 IgG 中分离出来，在人源化单抗浓度高达 3mg/mL 的情况下，蛋白 A 的检测限可至 78pg/mL 以下。
检测原理：
此试剂盒采用定量双抗夹心酶联免疫分析方法。酶标板预先包被蛋白 A 的特异性单克隆抗体，再将含有蛋白 A 的 样品用样品稀释液进行稀释，然后同酸化液混合使蛋白 A 从抗体中分离出来，样品中蛋白 A 和预包被在酶标板上的蛋 白 A 捕获抗体结合。再加入生物素标记的检测抗体结合形成夹心三明治复合物。然后洗涤去除没有参与反应的物质， 加入亲和素标记的 HRP，短暂孵育后洗涤，再进行 TMB 显色，然后加入终止液终止显色反应，在 450nm 处检测吸光值， 检测所得 OD 值和样品含量成正相关。
需要额外提供的器材：
1. 多道和单道 10-1000μL 的移液器，
2. 100mL 和 1000mL 的烧杯
3. 去离子水或蒸馏水
4. 各种型号溶液稀释管及样品处理管
5. 酶标仪（测 450nm）
6. 数据处理分析软件
组成成分：
试剂准备：
1. 本试剂盒使用前请恢复至室温（20-25℃）。
2. 洗涤液配制：
30mL 洗涤液（10x）中加入 270mL 去离子水，混匀配成 300mL 工作洗涤液。如果里面有结晶，请溶 解混匀后再使用。洗涤工作液最好现用现配， 剩余工作液可在 2-8℃保存两周。
3. 标准品稀释：
取 8 个离心管标记 1#-8#，取 990μL 样品稀释液加入到 1#和 2#管中，再取 500μL 样品稀释液加入到 3#-8#管中。
取 10μL 样品标准品加入到 1#管中，涡旋混匀后取 10μL 加入到 2#管中涡旋混匀。然后取 2#管 500μL 液体加入到 3#管 中涡旋混匀，再取 3#管 500μL 液体至 4#管中涡旋混匀，如此直至 8#管。
稀释完之后 ，2#-8#离心管中 Protein A 标准品的浓度分别为 5、2.5、1.25、0.625、0.3125、0.156、0.078ng/mL。
另外标记一管加入样品稀释液 500μL，浓度为 0ng/mL。
标准品和样品准备好之后就进入样品处理程序。
4. 其他试剂不用稀释可直接使用。
样品处理：
1. 样品如需稀释，请用试剂盒内的样品稀释液在 96 孔板或 EP 管中进行稀释。
2. 向每个样品处理孔（管）加入体积 100μL 的代测样本。
3. 加入 100μL 的标准品和质控品到对应孔（管）内。
4. 每个孔再加入 50μL 酸化液，用以移液器吹打至少 15 次混匀（如果用 EP 管，可将 EP 管涡旋数秒）。
5. 室温放置 5-10min（使样品中 proteinA 和抗体酸化分离）。
操作步骤：
1. 向包被有 protein A 抗体的酶标板中加入 100μL/孔的生物素标记的结合抗体。
2. 再加入 25μL 酸化处理好的标准品、样品、质控品和空白到对应的孔里，室温孵育 1h。
3. 甩干，用工作洗涤液 250μL/孔洗涤 4 次之后，拍干。加入 100μL/孔的亲和素标记 HRP，室温孵育 10min。
4. 甩干，用工作洗涤液 250μL/孔洗涤 4 次之后，拍干。
5. 加入 100μL/孔的 TMB 显色液，室温静置 10min。再加入 100μL/孔终止液，然后在 450nm 处检测吸光值。
数据处理和结果分析：
利用软件（如 Curve Expert 或 ELISA Calc）来建立检测标准曲线。把 OD 值（纵坐标）和标准品浓度（横坐标） 的对应关系用 4 参数逻辑拟合或三次多项式线性拟合成标准曲线，然后把检测样品的 OD 值带入相应曲线方程计算出 对应的样品浓度典型的标准品检测数据和曲线拟合：
分析指标：
1、精密度：在样品浓度大于 0.3ng/mL 的时候，检测变异系数小于 10%；样品浓度小于 0.3ng/mL 的时候，检测变异系数略大于 10%。
2、建议检测具体样品的时候，采用添加质控品的方法来监测样品基质效应对检测结果的影响。
3、本试剂盒的灵敏度为 0.02ng/mL。
4、勾状效应：本试剂盒是双抗夹心一步法，产生勾状效应的浓度为 10μg/mL。
注意事项：
1. 本试剂盒只可用于科研生产，不可用于体外诊断。
2. 终止液是 2M 的硫酸，避免接触到眼睛、皮肤和衣物。除此之外，本试剂盒中的试剂不会对人体有任何伤害。
3. 高或低的 pH 值，洗涤剂，尿素，高盐浓度和有机试剂都是 ELISA 方法的影响因素，pH 的影响很大，样品 PH 值应控 制在 7.0-7.4